Produção, imobilização por Cross-Linked Enzyme Aggregates (CLEAS) e aplicação de lacases fúngicas na biodegradação de ciprofloxacino
The occurrence and adverse impacts on health and the environment caused by emerging contaminants (EC) have been of considerable concern in recent years. Especially for antibiotics, their widespread presence in the environmental compartments, due to inadequate disposal or high percentage of excretion...
| Autor principal: | Braga, Dayane Moreira |
|---|---|
| Formato: | Dissertação |
| Idioma: | Português |
| Publicado em: |
Universidade Tecnológica Federal do Paraná
2022
|
| Assuntos: | |
| Acesso em linha: |
http://repositorio.utfpr.edu.br/jspui/handle/1/27087 |
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riut-1-270872022-02-12T06:05:58Z Produção, imobilização por Cross-Linked Enzyme Aggregates (CLEAS) e aplicação de lacases fúngicas na biodegradação de ciprofloxacino Production, imobilization by Cross-Linked Enzyme Aggregates (CLEAs) and application of fungi laccases in the biodegradation of ciprofloxacin Braga, Dayane Moreira Maciel, Giselle Maria http://lattes.cnpq.br/1525661213489573 Brugnari, Tatiane https://orcid.org/ 0000-0003-2864-7976 http://lattes.cnpq.br/4563253301000671 Souza, Cristina Giatti Marques de https://orcid.org/0000-0001-7295-758X http://lattes.cnpq.br/8102628645656210 Brugnari, Tatiane https://orcid.org/ 0000-0003-2864-7976 http://lattes.cnpq.br/4563253301000671 Peralta, Rosane Marina https://orcid.org/0000-0001-5749-0723 http://lattes.cnpq.br/7046351448775946 Biodegradação Água potável - Contaminação Enzimas de fungos Antibióticos - Contaminação Fungos - Cultivo Biodegradation Drinking water - Contamination Fungal enzymes Antibiotics - Contamination Fungi - Planting CNPQ::ENGENHARIAS::ENGENHARIA SANITARIA::SANEAMENTO AMBIENTAL Ciências Ambientais The occurrence and adverse impacts on health and the environment caused by emerging contaminants (EC) have been of considerable concern in recent years. Especially for antibiotics, their widespread presence in the environmental compartments, due to inadequate disposal or high percentage of excretion after administration, can trigger the development and dissemination of bacterial resistance, a serious public health problem. Until now, several approaches have been investigated for the removal of drugs present in effluents through alternative to conventional treatment strategies. In this context, enzymatic biodegradation, mainly with the use of laccases (EC 1.10.3.2), has received considerable attention. To improve enzymatic stability and enable the reuse of laccases in biocatalytic cycles, different immobilization techniques are employed, including the Cross-Linked Enzyme Aggregates (CLEAs) methodology. In this work, laccases were produced under two conditions using white rot fungi: (i) by monoculture of Trametes villosa and (ii) by co-culture of T. villosa with Pycnoporus sp., reported for the first time in the literature. The crude extract of T. villosa and Pycnoporus sp., expressed as main proteins laccases with apparent molecular masses between 55 and 45 kDa and both were identified in the co-culture. The crude extracts from the two cultures were immobilized by CLEAs, using 75% ammonium sulfate as a precipitant and glutaraldehyde as a crosslinking agent at concentrations of 200 mM for T. villosa laccases (Lac-TvL) and 162.5 mM for co-culture laccases (Lac-CO). After optimization, the enzymatic recoveries corresponded to 27.77± 1.07% for T. villosa CLEAs (CLEAs-TvL) and 35.38 ± 0.95% for co-culture CLEAs (CLEAs-CO), after 3h of reaction at 22 °C, statically. Lac-CO in its free form showed greater thermal and pH stability than Lac-TvL. Free and immobilized laccases showed optimal temperature for catalytic activity between 50 to 60 °C and optimal acidic pH (between 2.4 and 3.0). The immobilization of extracts increased the thermostability at 40 °C, retaining 100% of the residual activity after 180 min of reaction, while the free forms Lac-TvL and Lac-CO maintained 82.08 ± 1.14% and 89.98± 1.90% activity, respectively. At 55 °C, CLEAs-TvL maintained 79.37 ± 0.40%, a value 1.5 times greater than that obtained for the free form after 180 min; while CLEAs-CO presented 88.59 ± 0.52% of residual activity, 11% more than free Lac-CO. Free laccases and CLEAs removed with the same efficiency the drug ciprofloxacin (2.5 mg L-1), reaching 53 to 62% of biodegradation after 24h of reaction (40 °C and 150 rpm) with the use of 4-hydroxybenzoic acid (HBA) as a mediator, with reduced antimicrobial action on strains of Escherichia coli. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) A ocorrência e os impactos adversos à saúde e ao meio ambiente causados pelos contaminantes emergentes (CE) têm despertado considerável preocupação nos últimos anos. Especialmente para os antibióticos, a presença generalizada em compartimentos ambientais, em decorrência do descarte inadequado ou da alta porcentagem de excreção após a administração, pode desencadear o desenvolvimento e a disseminação da resistência bacteriana, um problema grave de saúde pública. Até o momento, várias abordagens foram investigadas para a remoção dos fármacos presentes em efluentes através de estratégias de tratamentos alternativos aos convencionais. Nesse contexto, a biodegradação enzimática, principalmente com o uso de lacases (EC 1.10.3.2), recebeu considerável atenção. Para melhorar a estabilidade enzimática e possibilitar o reuso das lacases em ciclos biocatalíticos, diferentes técnicas de imobilização são empregadas, incluindo a metodologia Cross-Linked Enzyme Aggregates (CLEAs). Neste trabalho, lacases foram produzidas em duas condições utilizando fungos da podridão branca: (i) por monocultivo do Trametes villosa e (ii) pelo cultivo em pares do T. villosa com Pycnoporus sp., reportado pela primeira vez na literatura. O extrato bruto de T. villosa e de Pycnoporus sp., expressaram como proteínas principais lacases com massas moleculares aparentes entre 55 e 45 kDa e ambas foram identificadas no co-cultivo. Os extratos brutos dos dois cultivos foram imobilizados por CLEAs, utilizando sulfato de amônio 75% como precipitante e glutaraldeído como agente reticulador nas concentrações de 200 mM para lacases de T. villosa (Lac-TvL) e 162,5 mM para lacases do co-cultivo (Lac-CO). Após otimização as recuperações enzimáticas corresponderam a 27,77 ± 1,07% para CLEAs de T. villosa (CLEAs-TvL) e 35,38 ± 0,95% para CLEAs do co-cultivo (CLEAs-CO), após 3h de reação a 22 °C, de modo estático. As Lac-CO em sua forma livre demonstraram maior estabilidade térmica e ao pH do que as Lac-TvL. Lacases livres e imobilizadas apresentaram temperatura ótima para atividade catalítica entre 50 a 60 °C e pH ótimo ácido (entre 2,4 a 3,0). A imobilização dos extratos aumentou a termoestabilidade a 40 °C, retendo 100% da atividade residual após 180 min de reação, enquanto as formas livres Lac-TvL e LacCO mantiveram 82,08 ± 1,14% e 89,98 ± 1,90% de atividade, respectivamente. Em 55 °C, CLEAs-TvL mantiveram 79,37 ± 0,40%, valor 1,5 vezes maior do que foi obtido pela forma livre após 180 min; enquanto os CLEAs-CO apresentaram 88,59 ± 0,52% de atividade residual, 11% a mais do que Lac-CO livres. Lacases livres e CLEAs removeram com a mesma eficiência o fármaco ciprofloxacino (2,5 mg L-1), atingindo de 53 a 62% de biodegradação após 24h de reação (a 40 °C e 150 rpm) com o uso de ácido 4-hidroxibenzóico (HBA) como mediador, com redução da ação antimicrobiana sobre cepas de Escherichia coli. 2022-02-11T19:57:10Z 2022-02-11T19:57:10Z 2021-10-15 masterThesis BRAGA, Dayane Moreira. Produção, imobilização por Cross-Linked Enzyme Aggregates (CLEAS) e aplicação de lacases fúngicas na biodegradação de ciprofloxacino. 2021. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia Ambiental) - Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Curitiba, 2021. http://repositorio.utfpr.edu.br/jspui/handle/1/27087 por openAccess http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ application/pdf Universidade Tecnológica Federal do Paraná Curitiba Brasil Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia Ambiental UTFPR |
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Biodegradação Água potável - Contaminação Enzimas de fungos Antibióticos - Contaminação Fungos - Cultivo Biodegradation Drinking water - Contamination Fungal enzymes Antibiotics - Contamination Fungi - Planting CNPQ::ENGENHARIAS::ENGENHARIA SANITARIA::SANEAMENTO AMBIENTAL Ciências Ambientais Braga, Dayane Moreira Produção, imobilização por Cross-Linked Enzyme Aggregates (CLEAS) e aplicação de lacases fúngicas na biodegradação de ciprofloxacino |
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The occurrence and adverse impacts on health and the environment caused by emerging contaminants (EC) have been of considerable concern in recent years. Especially for antibiotics, their widespread presence in the environmental compartments, due to inadequate disposal or high percentage of excretion after administration, can trigger the development and dissemination of bacterial resistance, a serious public health problem. Until now, several approaches have been investigated for the removal of drugs present in effluents through alternative to conventional treatment strategies. In this context, enzymatic biodegradation, mainly with the use of laccases (EC 1.10.3.2), has received considerable attention. To improve enzymatic stability and enable the reuse of laccases in biocatalytic cycles, different immobilization techniques are employed, including the Cross-Linked Enzyme Aggregates (CLEAs) methodology. In this work, laccases were produced under two conditions using white rot fungi: (i) by monoculture of Trametes villosa and (ii) by co-culture of T. villosa with Pycnoporus sp., reported for the first time in the literature. The crude extract of T. villosa and Pycnoporus sp., expressed as main proteins laccases with apparent molecular masses between 55 and 45 kDa and both were identified in the co-culture. The crude extracts from the two cultures were immobilized by CLEAs, using 75% ammonium sulfate as a precipitant and glutaraldehyde as a crosslinking agent at concentrations of 200 mM for T. villosa laccases (Lac-TvL) and 162.5 mM for co-culture laccases (Lac-CO). After optimization, the enzymatic recoveries corresponded to 27.77± 1.07% for T. villosa CLEAs (CLEAs-TvL) and 35.38 ± 0.95% for co-culture CLEAs (CLEAs-CO), after 3h of reaction at 22 °C, statically. Lac-CO in its free form showed greater thermal and pH stability than Lac-TvL. Free and immobilized laccases showed optimal temperature for catalytic activity between 50 to 60 °C and optimal acidic pH (between 2.4 and 3.0). The immobilization of extracts increased the thermostability at 40 °C, retaining 100% of the residual activity after 180 min of reaction, while the free forms Lac-TvL and Lac-CO maintained 82.08 ± 1.14% and 89.98± 1.90% activity, respectively. At 55 °C, CLEAs-TvL maintained 79.37 ± 0.40%, a value 1.5 times greater than that obtained for the free form after 180 min; while CLEAs-CO presented 88.59 ± 0.52% of residual activity, 11% more than free Lac-CO. Free laccases and CLEAs removed with the same efficiency the drug ciprofloxacin (2.5 mg L-1), reaching 53 to 62% of biodegradation after 24h of reaction (40 °C and 150 rpm) with the use of 4-hydroxybenzoic acid (HBA) as a mediator, with reduced antimicrobial action on strains of Escherichia coli. |
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BRAGA, Dayane Moreira. Produção, imobilização por Cross-Linked Enzyme Aggregates (CLEAS) e aplicação de lacases fúngicas na biodegradação de ciprofloxacino. 2021. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia Ambiental) - Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Curitiba, 2021. |
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